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Resumen Antecedentes extracelular proteína tumor translationally controlada (TCTP) se sabe que juega un papel en las respuestas alérgicas humanos. TCTP se ha identificado fuera de los macrófagos, en células mononucleares activados, y en los fluidos biológicos de los pacientes alérgicos. Incluso TCTP desprovisto de secuencias de señal, es secretada al medio extracelular por un mecanismo aún no definido. Este estudio está dirigido a comprender el mecanismo de liberación TCTP y su regulación. Un objetivo secundario es para ver si inhibidores de la liberación TCTP pueden servir como potenciales fármacos anti-asmáticos alérgicos. Hallazgos Metodología / Principal usando el ensayo de transferencia de Western en HEK293 y células U937, se encontró que la secreción de TCTP se reduce por omeprazol y pantoprazol, ambos de los cuales son inhibidores de la bomba de protones. A continuación, transfectadas HEK293 células con vectores de expresión de la bomba de protones para buscar los efectos de forma exógena overexpressed H / K ATPasa en la secreción de TCTP. Basándose en estos datos in vitro nos registramos los efectos in vivo de pantoprazol en un modelo murino de alergia inducida por ovoalbúmina. El omeprazol y pantoprazol reducción de la secreción de TCTP HEK293 y células U937 de una manera dependiente de la concentración y la secreción de TCTP a partir de células HEK293 aumentaron cuando se sobre-expresan H / K ATPasa. En un modelo murino de alergia inducida por ovoalbúmina, el pretratamiento con pantoprazol reducción de la infiltración de células inflamatorias, el aumento de las células caliciformes, y aumento de la secreción TCTP inducida por OVA desafío. Conclusión Desde omeprazol y pantoprazol disminuyen la secreción de TCTP que se asocia con el desarrollo de la reacción alérgica, que puede tener el potencial para servir como fármacos anti-alérgicas (asmáticos). Citas: Choi Min S, HJ, Kim Hwang M, ES, K Lee (2009) Inhibidores de la bomba de protones ejercen Antialérgicos efectos mediante la reducción de la secreción TCTP. PLoS ONE 4 (6): e5732. doi: 10.1371 / journal. pone.0005732 Editor: Jacques Zimmer, Centro de Investigación Pública de la Sant (CRP-Sant), Luxemburgo Recibido: 8 de Abril de 2009 Aceptado: May 1, 2009 Publicado: 1 de junio 2009 Copyright: 2009 Choi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan. Financiación: Este trabajo fue apoyado por la beca de la Fundación Corea Ciencia e Ingeniería (KOSEF), financiado por el gobierno de Corea (MOST) (R01-2007-000-20263-0), Programa de RBD Seúl (10541), y el programa de NCRC MÁS / KOSEF (R15-2006-020). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia. Introducción traduccionalmente proteína tumoral controlada (TCTP) se expresa en casi todos los tejidos de mamíferos. Los niveles intracelulares TCTP responden a diversas señales extracelulares y agentes tales como factores de crecimiento, citoquinas y condiciones de estrés 1 3. extracelular TCTP También se ha informado que estar presente en los sobrenadantes de cultivos de células U937 humano macrófagos 4. exterior de las células mononucleares y plaquetas, en los lavados nasales, fluidos de ampollas de la piel, y los fluidos de lavado broncoalveolar (BAL) durante las reacciones alérgicas finales de 5 9. TCTP recombinante humano estimula la secreción de histamina, IL-4 e IL-13 a partir de basófilos. TCTP también provoca la quimiotaxis y la IL-8 secreción de eosinófilos 10. 11. La mayoría de las proteínas secretoras tienen una secuencia de señales compuestas de 1330 aminoácidos hidrófobos en sus extremos N-terminales. Algunas proteínas sin líder, sin embargo, pueden salir de una célula de una manera independiente ER-Golgi, por ejemplo, interleucinas 1 y 1, FGF2, tiorredoxina, lipocortina, galectina, HIV-TAT proteínas, anexina, y proteínas conducto deferente. TCTP, sin secuencia líder clásica que pudiera explicar su presencia extracelular, pertenece a estas proteínas inusuales, que la salida de una célula sin pasar por la vía de secreción clásica 12. 13. ¿Cómo estas proteínas no son clásicamente secretada desde la célula aún no ha sido definida. Contrariamente a una percepción temprana, la liberación selectiva de las proteínas sin líder puede distinguirse inequívocamente de la secreción de proteínas mediada por ER-Golgi convencional que no es una consecuencia de la alteración de la integridad de la membrana plasmática o la muerte celular. Se propusieron varios mecanismos posibles para dicha secreción de la proteína no convencional, que implica: lisosomal y la secreción exosomal, los transportistas residentes de la membrana plasmática, y la formación de ampollas en la membrana 14. sino una comprensión definitiva del mecanismo de secreción de proteínas sin líder no ha surgido. El omeprazol es un ingrediente activo de Prilosec, que se utiliza para tratar la úlcera péptica. Es un inhibidor específico de la H gástrico humano / K ATPasa 15. que a pH neutro, impregna las membranas celulares y se acumula en los compartimentos celulares ácidos, tales como los lisosomas, donde se somete a protonación. La forma protonada se convierte en un compuesto de sulfenamida activo y actúa como un potente inhibidor de la bomba de protones (PPI) 16. omeprazol activado ha demostrado inhibir H gástrico humano / K ATPasa y detener la secreción de ácido por las células parietales 17. Pantoprazol es una forma modificada de omeprazol y también es también un PPI. IBP también se han demostrado para inhibir funciones de los neutrófilos 18, que incluye la adhesión a células endoteliales 19. 20. fagocitosis, la acidificación de fagolisosomas 21. y producción de intermediarios reactivos de oxígeno 22. Aunque la secreción de TCTP está bien documentada, cómo se regula no está claro. Debido a que los factores que contribuyen a su secreción y los mecanismos subyacentes siguen sin estar claras probamos varios inhibidores de la ATPasa (Na / K ATPasa, plasmamembrane H / K ATPasa, Ca2 plasmamembrane - ATPasa), basado en el informe que la liberación de FGF-2 se relaciona a Na / K ATPasa inhibidores de 23. Se encontró que el omeprazol y pantoprazol inhiben la liberación de TCTP de una manera dependiente de la concentración in vitro. Se confirmó este fenómeno in vivo y llegamos a la conclusión de que el omeprazol y pantoprazol tienen el potencial asmática antialérgica mediante la reducción de la secreción de TCTP. Métodos de anticuerpos de ratón 12CA5 anticuerpo monoclonal anti-HA, de conejo purificado anti-GFP anticuerpo policlonal, ratón anti-Na / K ATPasa anticuerpo monoclonal 1 (C464.6), y el anticuerpo monoclonal M2 anti-FLAG se compraron de Zymed Laboratories Inc. InVitrogen , Upstate, y Sigma, respectivamente. Cultivo de células y ensayos de secreción celular HEK293 (ATCC) se cultivaron en Dulbecco modificado medios Eagles (DMEM Invitrogen) que contiene 10 suero bovino fetal, 1 de penicilina-estreptomicina, glutamina 2 mM, y HEPES 20 mM. Las células U937 (ATCC) se cultivaron en RPMI-1640 (Invitrogen) que contiene 10 suero fetal bovino, 1 de penicilina-estreptomicina y HEPES 10 mM. En el día del experimento, las células HEK293 se separaron de las placas de cultivo, utilizando con tripsina-EDTA, y se lavaron dos veces con medio libre de suero. Las células U937 se recogieron por centrifugación y se lavaron dos veces con medio libre de suero. Las células recogidas se tiñeron con azul de tripano, se contaron las células vivas, y se sembraron. Las células se resuspendieron en medio libre de suero y se incubaron durante los tiempos indicados con o sin omeprazol (Sigma) y pantoprazol (Byk Gulden, Alemania) o ionomicina (Sigma). La viabilidad celular se evaluó mediante exclusión con azul de tripano o CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Japón). Al final de la incubación, se recogieron los sobrenadantes y se centrifugaron (300 g) durante 5 min para eliminar las células no adherentes. Los sobrenadantes se centrifugaron de nuevo (5.000 g) durante 10 min para eliminar los desechos celulares y los núcleos y se concentraron por centrifugación usando Vivaspin 500 (10.000 de peso molecular de corte Sartorius, Francia), y se resuspendieron en tampón de muestra SDS 4. Cada muestra (cantidad indicada de proteínas totales se resolvió por SDS-PAGE. Las células se solubilizaron en tampón de lisis que contiene 1 Nonidet P-40, 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,25 desoxicolato, 2 ortovanadato de sodio mM, fluoruro de sodio 1 mM y mezcla de inhibidores de proteasa. Después de la transferencia las membranas se transfirieron de forma rutinaria. plásmido construcción Para construir el plásmido, TCTP humano / p3XFLAG-CMV-14, inserto TCTP humano se realizó mediante amplificación por PCR utilizando cebadores con Bam .. HI y sitios Eco RI inserto de ADN y p3XFLAG-CMV-14 vector vacío se escindieron mediante Bam HI y Eco RI enzimas de restricción y pegajosa de extremo se ligó el plásmido se confirmó mediante secuenciación de ADN Para construir el plásmido, rata H / K. - ATPasa 1 / pEGFP-N1, rata H / K ATPasa 1 inserto se hizo mediante amplificación por PCR usando cebadores con sitios Hind III y Xho I. inserto de ADN y pEGFP-N1 vector vacío se escindieron mediante Hind III y Xho I enzimas de restricción y pegajosa - END ligar. El plásmido se confirmó mediante secuenciación de ADN. Rat Na / K ATPasa 1 / pcDNAI-neo se construyó como se ha descrito previamente 24. células HEK293 transfecciones se sembraron y un día más tarde, transfectadas por el método de precipitación Ca 2 PO 4 o reactivo WelFect EX PLUS (WelGene, Corea). En triples transfecciones, la relación de rata H / K ATPasa 1-GFP: HA-rata Na / K ATPasa 1: bandera humano TCTP-3X era 311. ensayos de secreción se realizaron después de 2 días. En algunos experimentos, se añadió omeprazol o pantoprazol durante el ensayo de secreción. Desarrollo de los ratones inflamación de las vías macho BALB / c se adquirieron de la Lab Central. Animal Inc. (Corea), y se mantuvieron en nuestro estabulario durante al menos 1 semana antes de su uso. Todos los animales fueron manejados en estricta conformidad con las buenas prácticas animal definidas en los órganos de carácter nacional y / o local de los animales pertinentes, y todos los animales de trabajo fue aprobado por Mujeres Ewha Universitys cuidado animal institucional y el empleo. Los ratones se sensibilizaron en día 0, y en el día 14, con la inyección intraperitoneal (i. p.) de OVA (Sigma, 50 g por cada uno) en alumbre (Thermo científica). A partir del día 28, los ratones sensibilizados fueron desafiados con inyecciones intranasales diarias (con Pipetman) de PBS o OVA (300 g por cada uno) durante siete días. Para el tratamiento pantoprazol, los ratones se trataron previamente (ip) con la dosis indicada de Pantoloc que contiene como ingrediente activo pantoprazol (Byk Gulden, Alemania) 30 min antes de la OVA desafío y sacrificados el día 37. broncoalveolar fluidos de lavado pulmonar (BALF) y los pulmones fueron recolectados. Western blot para la detección TCTP se realizó en BALF. Pulmón analiza Los tejidos pulmonares se fijaron en paraformaldehído al 4, se deshidrataron en alcohol, se incluyeron en parafina y cortadas en rodajas gruesas 5 m. sección de tejido se tiñó con solución PAS (Sigma). Las imágenes fueron adquiridas mediante microscopio óptico (Nikon Eclipse E200, Japón). Estadísticas Los datos se expresan como meanS. D. Significaciones de las diferencias entre los dos grupos se determinaron utilizando el estudiantes no apareados t-test. La significación estadística se fijó en p 0,05. Resultados El omeprazol y pantoprazol inhiben la secreción TCTP a partir de células U937 y HEK293 Se estableció por primera vez el período de incubación necesario para la detección de TCTP secretada. Extracelular TCTP fue identificado por primera vez en los sobrenadantes de las células U937 4 y más estudios sobre la liberación de TCTP se realizaron utilizando células HEK293. Las células U937 se incubaron en medio RPMI libre de suero durante 0, 1, 2, 3, 4, o 5 h, y se procesaron los sobrenadantes y las células recogidas, resueltas por SDS-PAGE, inmunotransferencia y para TCTP. La cantidad secretada de TCTP aumentó con el tiempo de incubación y alcanzó el máximo después de 5 h de incubación (Figura 1A). Para asegurarse de que TCTP el resultado de un proceso de secreción activa en lugar de la contaminación de la lisis celular o la liberación no específica, los sobrenadantes también se inmunotransfirieron contra-tubulina, una de las abundantes proteínas citosólicas. tubulina Beta se identificó claramente en lisados ​​celulares pero no en los sobrenadantes correspondientes (Figura 1A). En las células HEK293, que era difícil de detectar la secreción de TCTP endógeno. Por lo tanto, las células HEK293 se transfectaron con TCTP-3xFLAG y 2 días más tarde colocaron en medio libre de suero y sus sobrenadantes se analizaron para la presencia de TCTP. células HEK293 transfectadas se incubaron en medio DMEM libre de suero durante 0, 0,5, 1, o 3 h, y se procesaron los sobrenadantes y las células recogidas, y se resolvieron por SDS-PAGE, inmunotransferencia y para TCTP-3xFLAG. Por 1 h, de forma exógena expresó TCTP se detectó en los sobrenadantes derivados de células HEK293 que estos niveles no se introdujeron mejoras adicionales a las 3 h. Al igual que con U937, que no había evidencia de la lisis celular o la liberación de proteína no específica (Figura 2A). Expandir la Figura 1. secreción TCTP, tanto constitutiva e inducida de las células U-937 se inhibe por omeprazol y pantoprazol. (A) la secreción de TCTP se incrementa con el tiempo de incubación en medio acondicionado libre de suero. - tubulina es un control de carga en las células, mientras que es un marcador de la lisis celular en los medios de comunicación. WB: anti - tubulina Ab (anticuerpo policlonal de conejo, H-235, Santa Cruz Biotechnology) y anti-TCTP Ab (antisuero policlonal de conejo, generado utilizando recombinante TCTP marcada con His como el inmunógeno), (B) tratamiento con omeprazol durante la incubación en medio acondicionado (5 h) es capaz de disminuir la secreción de TCTP de manera dependiente de la concentración. O en el gráfico significa omeprazol. WB: anti-TCTP Ab, el tratamiento (C) Pantoprazol (5 h) inhibe la secreción de TCTP de manera dependiente de la concentración. P en el gráfico significa pantoprazol. WB: anti-TCTP Ab, (D) Ambos de omeprazol (O) y pantoprazol (P) pre-tratamientos a reducir la secreción TCTP inducida por ionomicina (IM) de tratamiento (2 M, 10 min). Se utilizaron 1 M omeprazol y pantoprazol 100 M. Ambos productos químicos fueron tratados 1 h antes de ionomicina tratamiento. WB: anti-TCTP Ab. Los datos del Panel B Para el panel D representan meansS. D. de tres experimentos independientes. : Inhibición, P0.01, células frente a no tratados. Más Expandir la Figura 2. La secreción de TCTP expresado exógenamente en células HEK293 se inhibe por omeprazol y pantoprazol. (A) la secreción de TCTP se incrementa con el tiempo de incubación en medio acondicionado libre de suero. - tubulina es un control de carga en las células, mientras que es un marcador de la lisis celular en los medios de comunicación. WB: anti - tubulina Ab y Ab anti-flag, (B) tratamiento con omeprazol durante la incubación en medio condicionado (3 h) es capaz de disminuir la secreción de TCTP de manera dependiente de la concentración. O en el gráfico significa omeprazol. WB: anti-FLAG Ab, el tratamiento (C) Pantoprazol (3 h) inhibe la secreción de TCTP de manera dependiente de la concentración. P en el gráfico significa pantoprazol. WB: anti-flag Ab, (D) Ambos de omeprazol (O) y pantoprazol (P) pre-tratamientos reducen el tratamiento ionomicina inducida por la secreción de TCTP (IM) (2 M, 10 min). Se utilizaron 1 M omeprazol y pantoprazol 100 M. Ambos productos químicos fueron tratados 1 h antes de ionomicina tratamiento. WB: anti-FLAG Ab. Los datos del Panel B Para el panel D representan meansS. D. de tres experimentos independientes. : Inhibición, P0.01, células frente a no tratados. Cuando se realizaron los ensayos de secreción con medio libre de suero suplementado con omeprazol o pantoprazol, las cantidades de TCTP detectadas en el medio acondicionado se redujeron de una manera dependiente de la concentración. En las células U937, 10 M omeprazol reduce la secreción de TCTP en alrededor de 60 (Figura 1B), y por 50 con 100 M pantoprazol (Figura 1C). En las células HEK293, la reducción de la secreción de TCTP fue 60 y 40 para el omeprazol y pantoprazol, respectivamente (Figura 2B, 2C). En estos experimentos, se utilizó omeprazol a una concentración más baja que pantoprazol por las siguientes razones. En primer lugar, omeprazol mostró un efecto citotóxico a concentraciones superiores a 100 M, probablemente debido a la inhibición excesiva de H / K ATPasa. En segundo lugar, el pantoprazol reconstituido causó la precipitación después de la congelación y descongelación y precipitación provoca una reducción en la actividad. Para evitar este tipo de precipitaciones, que se disolvió tan pronto como se reconstituyó, y se dividió en pequeñas partes alícuotas. La viabilidad de las células tratadas por omeprazol y pantoprazol se confirmó con azul de tripano o kit CCK-8 no hubo diferencia significativa entre las células no tratadas y tratadas. La inhibición de la secreción TCTP por omeprazol y pantoprazol también fue visto en ionomicina (IM) células tratadas. IM es un ionóforo de Ca 2 e induce la secreción de muchas proteínas en un proceso independiente ER-Golgi. Con las células U937, el tratamiento IM aumento de la secreción TCTP en aproximadamente un 50 y pre-tratamiento con omeprazol y pantoprazol bloqueado este aumento (Figura 1D). células HEK293 transfectadas con TCTP-3xFLAG también mostraron patrones similares (Figura 2D). Estos resultados indican que el omeprazol y pantoprazol inhiben la secreción de TCTP, independientemente de si éste se expresa endógenamente o exógenamente. También inductores de secreción no tuvieron efectos sobre estos fenómenos. subunidad de H / K ATPasa modula TCTP exportar el principal efecto de los IBP es la inhibición de la actividad de transporte de iones de H / K ATPasa mediante la unión a la subunidad catalítica. Desde omeprazol y pantoprazol inhibieron TCTP de exportación, se investigó si los cambios en el nivel de la subunidad H / K ATPasa afectan a la exportación TCTP. las células HEK293 se co-transfectaron con vectores de expresión de plásmido que codifica TCTP, rata 1 de la subunidad de H / K ATPasa, y la rata 1 de la subunidad de Na / K ATPasa. Como se muestra en la Figura 3B. co-sobreexpresión de 1 y 1 con TCTP elevados secreción TCTP en más de 60, en comparación con células de control que expresan sólo TCTP. Este incremento no se observó en las células transfectadas con 1 y TCTP excepto 1. Esto sugiere que el complejo de 1-subunidad y 1 subunidad es de alguna manera implicados en TCTP exportación. la secreción de TCTP inducida por la co-expresión de 1 y 1 se redujo en un pre-tratamiento de omeprazol y pantoprazol (Figura 3C). Pero sólo pantoprazol tenido un efecto estadísticamente significativo. Puesto que la concentración de omeprazol y pantoprazol utilizada en la figura 2 no fue suficiente para revertir el aumento de la liberación de TCTP, se utilizó una concentración diez veces. La viabilidad celular no se ha cambiado por estos tratamientos previos. Expandir la figura 3. aumento de la secreción TCTP por la sobre-expresión de la bomba de protones es inhibida por pantoprazol en HEK293. (A) Comparación de las expresiones de la proteína en el control y las muestras H. muestra de control se transfectaron con dos vectores vacíos (pEGFP-N1 y pcDNAI-neo) y TCTP-3xFLAG constructo. la muestra H se transfectadas con la rata H / K ATPasa 1-GFP, HA-rata Na / K ATPasa 1, y TCTP-3xFLAG construye. WB: anti-GFP Ab (anticuerpo policlonal de conejo purificado, InVitrogen), anti-HA Ab (anticuerpo 12CA5 monoclonal de ratón, Santa Cruz), y anti-flag Ab, (B) la secreción de TCTP se incrementa por la sobre expresión de H / K - ATPasa 1 y Na / K ATPasa 1. Ambos grupos de células se incubaron durante 3 h en medio acondicionado. WB: anti-flag Ab, (C) Los datos del ensayo de secreción de las células transfectadas con H / K ATPasa 1, Na / K ATPasa 1, y TCTP. El pantoprazol (1 mM) o omeprazol (1 mM) se trató durante ensayo de secreción de 3 h. O en el gráfico significa omeprazol y pantoprazol P hace. WB: anti-FLAG Ab. Los datos de panel B y C representan panel de meansS. D. de tres experimentos independientes. : Inhibición, P0.05, en comparación con las células transfectadas con dos vectores vacíos (pEGFP-N1 y pcDNAI-neo) y TCTP-3xFLAG construir. Efecto de pantoprazol en los niveles TCTP en los fluidos de BAL de los ratones sensibilizados con OVA Se ha demostrado que TCTP aparece en fluidos biológicos durante la reacción alérgica tardía 5 9. Se utilizaron los ratones OVA-desafió para examinar el efecto de pantoprazol en vivo. Ácido periódico-Schiff (PAS) tinción de secciones de pulmón mostró un marcado aumento de las células caliciformes granulares productoras de moco en las vías respiratorias proximales de ratones estimulados sensibilizados OVA-/ en relación con los ratones de control tratados con solución salina (Figura 4A). El aumento de las células caliciformes PAS positivo en los ratones se reduce por pretratamiento con pantoprazol en una forma dependiente de la dosis. Pantoprazol pre-tratamiento también redujo notablemente, la infiltración de la pared de las vías respiratorias por células inflamatorias PAS positivas. Aumento de las células caliciformes productoras de moco y la infiltración de células inflamatorias es una característica histopatológica prominente del pulmón asmático murino. Expandir la Figura 4. El pantoprazol alivia respuestas asmáticas e inhibe la secreción TCTP en ratones sensibilizados con OVA / impugnados. Resultados (A) tinción PAS de las secciones de pulmón. los ratones sensibilizados OVA-/ impugnados muestran una marcada aumento de las células caliciformes productoras de moco granulares en la relación alvéolos bronquial a la farsa ratones. Las células caliciformes positivas aumento de la PAS en ratones desafiados con OVA se redujeron en un pretratamiento pantoprazol en forma dependiente de la cantidad. pre-tratamiento Pantoprazol también redujo marcada infiltración de la pared de vía respiratoria por PAS células positivas inflamatorias, (B) los datos de transferencia Western utilizando BALF de modelo alérgica ratón. WB: anticuerpo anti-TCTP. Los ratones fueron sensibilizados con OVA y desafió con PBS u OVA cinco veces cada dos días. P significa pantoprazol y los números (10 y 100) dosis media indicada. : Inhibición, P0.01, frente al grupo de tratamiento simulado. farsa: control negativo, OVA sensibilizados pero no desafió, n 4. OVA: control positivo, OVA sensibilizados y desafió sin tratamiento previo, n 5. P 10: OVA sensibilizado y desafiado con pantoprazol 10 mg / kg de pretratamiento (30 min), n 6. P 100: OVA sensibilizado y desafiado con pantoprazol 100 mg / kg de pretratamiento (30 min), n 6. a continuación, se examinaron los cambios en la secreción TCTP en BAL fluidos. Como se muestra en la Figura 4B. OVA desafió a los ratones mostraron una mayor TCTP en los fluidos de BAL. Similar a los datos in vitro, el tratamiento previo pantoprazol inhibe la secreción de TCTP a la presente en grupo de tratamiento simulado. Estos resultados indican que el pantoprazol podría ejercer su efecto anti-alérgica bloqueando la secreción TCTP. Discusión TCTP se sabe que es una proteína secretada, pero los factores que contribuyen a su secreción y los mecanismos subyacentes siguen siendo poco clara. Existen muchos estudios sobre los mecanismos de secreción de la otra proteinsother no normalmente secretada de TCTP. Se ha informado de la secreción de la subunidad catalítica de la Na / K ATPasa estar relacionada con fibroblastos factor de crecimiento-2 (FGF-2). En este estudio, los autores buscaron algunas moléculas pequeñas que podrían causar perturbación específica de la membrana plasmática y interferir con la liberación de FGF-2. Se supone que hay un aparato de translocación de la membrana plasmática (PMTA) a través del cual se exporta FGF-2. Encontraron cardenolides como ouabaína inhiben la secreción de FGF-2 y que Na / K ATPasa actúa como un componente PMTA o regulador. Sobre la base de este informe, se realizaron búsquedas de los inhibidores que actúan sobre la membrana plasmática y inhiben la secreción de TCTP. Finalmente, se encontró que los inhibidores de la bomba de protones (IBP), tales como omeprazol y pantoprazol disminuyen la exportación TCTP sin líder. Posibles efectos citotóxicos de omeprazol y pantoprazol se puede descartar, ya que el azul de tripano o CCK-8 ensayo no mostraron efectos tóxicos cuando se utilizaron estos fármacos. Además, la reducción en la secreción de TCTP por los IBP no fue resultado de la síntesis de proteína alterada o el aumento de la inestabilidad de piscinas intracelulares, ya que el tratamiento con estos fármacos no modificó las cantidades de las proteínas intracelulares notablemente (Fig. 1B. 2B). El omeprazol se usa para tratar la úlcera péptica, porque es un inhibidor específico de la H gástrico humano / K ATPasa. Es un inhibidor de la bomba de protones (PPI). Otros productos químicos que contienen pantoprazol, rabeprazol, lansoprazol y esomeprazol son también los IBP. IBP interactúan con la subunidad catalítica de H / K ATPasa y de ese modo inhiben su capacidad de intercambio de K para H. hidrolizar ATP, y mantener un gradiente electroquímico a través de la membrana plasmática. Además de la reducción de la secreción de ácido gástrico mediante la inhibición H / K ATPasa, se han investigado diversos efectos biológicos de omeprazol, incluyendo antileishmanial (antimicrobiano) actividad 25. relajación de las arterias humanas 26. y la inhibición de la quimiotaxis de neutrófilos 27. Aunque el principal objetivo de los IBP se cree hasta ahora para ser H gástrica / K ATPasa (conocido por ser principalmente en las células parietales del estómago), otras moléculas, por ejemplo putativos H / K ATPasa que son sensibles a los IBP y no están relacionados con H gástrica / K - ATPasa o completamente nuevos objetivos distintos de la bomba de protones, pueden estar influenciados por los IBP, teniendo en cuenta los efectos de los IBP sobre los neutrófilos o arterias. Los datos presentados aquí sugieren que las nuevas actividades del IBP deben evaluarse a la luz de su papel como inhibidores de TCTP y en la exportación de proteínas no identificadas en el exterior mediante ER-Golgi vías de secreción independiente. Varios modelos posibles pueden enlazar, a nivel molecular, las acciones conocidas de los IBP, su efecto sobre su destino (el 1-subunidad de H / K ATPasa) y su capacidad para inhibir la TCTP exportación. Por ejemplo, el aparato de translocación exportación TCTP a partir de células puede ser regulada a través del gradiente electroquímico mantenido por H / K ATPasa. Si este modelo es correcto, hay que examinar la expresión de H / K ATPasa en las células U937 y HEK293. análisis de transferencia de Western usando los lisados ​​celulares de células U937 y HEK293, mostró varias bandas detectadas por el anticuerpo anti-H gástrico / K ATPasa (datos no mostrados). Sin embargo, las proteínas detectadas fueron menores de lo esperado. Esto indica la posibilidad de que H gástrica / K ATPasa no existe en estas células o que las nuevas formas modificadas de H gástrica / K ATPasa podría existir. También es posible que exista una nueva diana proteína IBP sensible que es distinta de la subunidad catalítica de H / K ATPasa, a pesar de que hasta el momento, el principal objetivo de unión de los IBP es la subunidad catalítica de H / K - ATPasa. A continuación posibilidad es el bloqueo H / K ATPasa puede modificar eventos intracelulares en curso, como la entrada de calcio y la movilización de calcio, y modular la liberación TCTP. En estudios previos, se informó de que los IBP pueden afectar a los niveles de calcio intracelular 28. 29 y tat exocitosis es uno de los mecanismos de secreción de TCTP 30. Los cambios en los niveles de calcio intracelular causados ​​por los IBP podría influir en la exocitosis y, posteriormente, la secreción de TCTP. TCTP se ha implicado en diversos procesos celulares, tales como el crecimiento celular, la progresión del ciclo celular, la transformación maligna, la protección de las células contra el estrés y la apoptosis. Además, un extracelulares funciones, por citoquinas como se han establecido para TCTP. Hasta el momento, no ha habido informes que muestran que los cambios en los niveles intracelulares TCTP influyen en la gravedad de las respuestas o la regulación de diversas citoquinas alérgicas alérgicas. Para TCTP para actuar como un regulador de las respuestas alérgicas, que debe ser liberado de las células. TCTP no puede afectar a las células efectoras abajo hasta que se secreta. Debido a su capacidad para inhibir la secreción de TCTP in vitro e in vivo. omeprazol y pantoprazol podrían ser potencialmente útiles como terapias anti-asmáticos alérgicos. Contribuciones de los autores concebido y diseñado los experimentos: ESH KL. Realizado los experimentos: SC HJM MK. Analizados los datos: SC ESH KL. Escribió el documento: SC KL. Referencias 1. Bommer U, Borovjagin A, Greagg M, Jeffrey I, Russell P, et al. (2002) El ARNm de la proteína P23 tumor translationally controlada / TCTP es un ARN altamente estructurado, que activa la proteína quinasa PKR dsRNA-dependiente. RNA 8: 478496. 2. Nielsen H, Johnsen A, Sánchez J, Hochstrasser D, Schitz P (1998) Identificación de una proteína regulada por la interleucina-3 basófilos de leucocitos que es idéntica al factor de liberación de histamina dependiente de IgE. Alergia 53: 642652. 3. Teshima S, Rokutan K, Nikawa T, Kishi K (1998) macrófagos, factor estimulante de colonias de estimula la síntesis y secreción de un homólogo de ratón de un factor de liberación de histamina dependiente de IgE humana por los macrófagos in vitro e in vivo. J Immunol 161: 63566366. 4. MacDonald S, T Rafnar, Langdon J, L Lichtenstein (1995) Identificación molecular de un factor liberador de histamina dependiente de IgE. 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